بررسي عفونت ريوي مايكوپلاسمايي ناشي از مايكوپلاسما مايكوئيدس واريته مايكوئيدس و مايكوپلاسما كاپري كولوم واريته كاپري كولوم در گوساله‌ها و بزهاي كشتارشده به روش PCR

فهرست
الف- مقدمه 1
ب-چکيده 3
فصل اول:کليات 5
1- تاريخچه 6
2- خصوصيات کلي مايکوپلاسما 6
3- مقاومت مايکوپلاسماها 8
4- طبقه بندي مايکوپلاسماها 9
5- طبقه بندي کلاستر مايکوئيدس 12
6- فيلوژني 14
7- ساختمان 15
1-7-ساختمان مايکوپلاسما مايکوئيدس 15
2-7- ساختمان مايکوپلاسما کاپري کولوم 17
8- بيولوژي مولکولي 19
9- توالي‌هاي تکراري 23
10- پروتئينهاي سطحي 25
11- فاکتور حدت 30
12- آناليز پروتئين 32
13- طبقه بندي سويه‌ها 34
14- مشخصات گونه مايکوئيدس 35
15- کشت و رشد گونه مايکوئيدس 38
16- کشت و رشد گونه کاپري کولوم 41
1-16- محيط Thiacourt 41
17- بيماري پلوروپنوموني واگير گاوان 44
1-17- علائم باليني 45
2-17- علائم کالبدگشايي بيماري 47
3-17- پاتوژنز 50
1-3-17- مکانيسمهاي مقابله با دستگاه ايمني 53
4-17- اختصاصيت ميزبان 57
5-17- انتقال بيماري 58
6-17- سير همه گيري 59
1-6-17- مخزن 59
2-6-17- راه انتقال 59
7-17- پيشگيري و کنترل 60
1-7-17- اقدامات لازم براي حفاظت مناطق عاري از بيماري 61
2-7-17- اقدامات لازم هنگام شيوع بيماري 62
3-7-17- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومي 63
18- بيماري پلوروپنوموني واگير بزان 63
1-18- علائم باليني 64
2-18- علائم کالبد گشايي 66
19- گونه مايکوپلاسما کاپريکولوم کاپريکولوم 69
1-19- سندروم MASKePs 70
2-19- علائم باليني 71
3-19- علائم کالبد گشايي 71
4-19- سندروم آگالاکتيه واگير 73
20- گونه مايکوپلاسما کاپري 73
1-20- بيماريزايي 73
2-20- علائم کالبد گشايي 74
21- سير همه‌گيري 75
1-21-مخزن 75
2-21-راه انتقال 76
3-21-جمعيت ميزبان 77
22-پيشگيري وکنترل 77
1-22- اقدامات لازم براي محافظت مناطق عاري از بيماري 77
2-22- اقدامات لازم هنگام شيوع بيماري 78
3-22- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومي 78
23-واکسن 79
1-23-واکسن MmmLC 79
2-23-واکسن Mccp 79
3-23-واکسن Mcc 79 79-اختصاصيت ميزبان در کلاستر مايکوئيدس ……………… 80
25-تشخيص افتراقي 80
1-25-شناسايي عامل بيماري زا 81
1-1-25-بررسي ميکروسکوپيک اگزوداي ريه از طريق تهيه اسمير يا برش بافتي 81
2-25- تشخيص آزمايشگاهي 81
1-2-25- روش کشت و جداسازي 81
1-1-2-25- انتخاب نمونه ها 82
2-1-2-25- آماده سازي نمونه ها 82
3-25- تستهاي بيوشيمي 83
4-25- روشهاي سرولوژي 85
1-4-25- عوامل موثر در آزمايشات سرولوژي 85
2-4-25- تست مهاري رشد 87
3-4-25- تست ايمونو فلورسانس 88
4-4-25- تست رسوب ژلي 88
5-4-25- تست فيکساسيون کامپلمان 89
6-4-25- تست ممانعت از هماگلوتيناسيون 89
7-4-25- تست آگلوتيناسيون لاتکس 90
8-4-25- تست اليزاي رقابتي 91
9-4-25- ساير تستهاي تشخيصي 94
5-25 – مشکلات روشهاي سنتي 94
6-25- تشخيص با استفاده از PCR 95
فصل دوم: روش کار
26- روش کار 101
1-26- جمع آوري نمونه 101
1-1-26- مواد لازم 101
2-1-26- بخش جمع آوري نمونه 101
3-1-26- نمونه برداري 103
2-26- کشت و جداسازي نمونه ها 104
1-2-26- مواد لازم 104
2-2-26- طرز تهيه محيط کشت اختصاصي براي جداسازي مايکوپلاسماي نشخوار کنندگان 106
1-2-2-26- مواد لازم 106
2-2-2-26- روش تهيه محيط کشت 107
3-26- استخراج DNA مايکوپلاسما 109
1-3-26- روش استخراج DNA از نمونه هاي ارسالي 109
4-26- فرايند PCR 110
1-4-26- مواد لازم 110
2-4-26- آماده سازي مواد جهت واکنش PCR 112
1-2-4-26- افزوده سازي DNA نمونه‌ها 112
2-2-4-26- افزوده سازي DNA کلونيهاي جدا شده 115
3-2-4-26- تهيه مخلوط اصلي اوليه 115
3-4-26- پرايمرها 115
4-26- واکنش PCR 117
5-26- تهيه ژل الکتروفورز 118
1-5-26- طرز تهيه محلول اتيديوم برمايد 119
6-26- الکتروفورز 121
7-26- رويت باندهاي ايجاد شده 122

فصل سوم: نتايج
27- نتايج 124
1-27- جداسازي 124
1-1-27- بررسي عملکرد محيط کشت 124
2-1-27- نتايج کشت نمونه هاي ارسالي 124
1-2-1-27- نتايج روز پنجم 125
2-2-1-27- نتايج روزهفتم تا دهم 125
3-2-1-27- نتايج روزپانزدهم 126
2-27- نتايج PCR 126
1-2-27- نتايج PCR نمونه ها با پرايمر جنس 126
2-2-27- تائيد کلوني هاي جدا شده 127
3-2-27- نتايج PCR نمونه ها با پرايمر کلاستر مايکوئيدس 127
4-2-27- نتايج PCR نمونه ها با پرايمر گونه آگالاکتيه 128
5-2-27- نتايج PCR نمونه ها با پرايمر گونه مايکوئيدس کلوني بزرگ 129
3-27- نتايج کالبد گشايي 130
1-3-27- معيار انتخاب 130
فصل چهارم: بررسي نتايج
نمودارها 131
فصل پنجم: بحث
28- بحث 139
1-28- ضايعات کالبد گشايي 139
2-28- ميزان وقوع عفونت تنفسي مايکوپلاسما 141
3-28- روش کشت 142
4-28- روش PCR 147
5-28- فراواني گونه ها 152
29- خلاصه انگليسي 159
30- منابع 160
فهرست تصاوير
تصوير شماره 1: کلوني تخم مرغي شکل مايکوپلاسما پس از سومين ساب کالچر 125

تصوير شماره 2: آزمايش PCR براي تشخيص جنس مايکوپلاسما در نمونه ريه 127

تصوير شماره 3: آزمايش PCR براي تشخيص کلاستر مايکوئيدس در نمونه ريه 128

تصوير شماره 4: آزمايش PCR براي تشخيص گونه آگالاکتيه درنمونه ريه 129
تصوير شماره 5: آزمايش PCR براي تشخيص گونه مايکوئيدس مايکوئيدس کلوني بزرگ 130
فهرست جداول
جدول1: طبقه بندي مايکوپلاسما 11
جدول 2: معرفي اعضا کلاستر مايکوئيدس و خصوصيات بيماريزايي آنها 11
جدول 3: احتياجات غذايي براي رشد مايکوپلاسماهاي کلاستر مايکوئيدس 39
جدول 4 : مقادير موردنياز جهت تهيه مخلوط اصلي اوليه 112
جدول 5: مواد مورد نياز واکنش تکثير 114
جدول6 : پرايمرهاي استفاده شده در واکنش تکثير 116
جدول 7 : برنامه واکنش پرايمرها 118
جدول8: : فرمول تهيه محيط TBE(5X) 120
جدول9: ميزان اتيديوم برومايد مصرفي جهت ساختن مقادير متفاوت ژل 120
نمودار شماره 1: درصد مايکوپلاسماي جدا شده به روش کشت در عفونت تنفسي
گله‌هاي مورد مطالعه 132
نمودارشماره 2: درصد حضور مايکوپلاسما درعفونت تنفسي گله‌هاي مورد
مطالعه به روشPCR 132
نمودار شماره3 : مقايسه روشهاي کشت و PCR در تشخيص مايکوپلاسما ي موجود در عفونت تنفسي گله‌هاي مورد مطالعه 133
نمودار شماره4: مقايسه نتايج کشت وPCR نمونه‌ها در گله‌هاي مورد مطالعه (n=100) 133
نمودار شماره 5: مقايسه نتايج کشت و PCR مايکوپلاسما در گاو (n=50) 134
نمودار شماره 6: مقايسه نتايج کشت و PCR مايکوپلاسما در گله هاي گوسفند (n=30) 134
نمودار شماره 7: مقايسه نتايج کشت و PCR در گله‌هاي بز (n=20) 135
نمودار شماره8: نمودار شماره 8:مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR مايکوپلاسما در گله‌هاي مورد مطالعه (n=100) 135
نمودار شماره 9: نمودار شماره9:مقايسه نتايج ايجاد کدورت در محيط براث و جداسازي مايکوپلاسما در گله‌هاي مورد مطالعه (n=100) 136
نمودار شماره 10: نمودار شماره10: مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR مايکوپلاسما
در گله‌هاي گاو(n=50) 136
نمودار شماره 11: نمودار شماره 11:مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR مايکوپلاسما
در گله‌هاي بز (n=20) 137
نمودار شماره12: مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR مايکوپلاسما در گله‌هاي گوسفند (n=30) 137