بررسی عفونت ریوی مایکوپلاسمایی ناشی از مایکوپلاسما مایکوئیدس واریته مایکوئیدس و مایکوپلاسما کاپری کولوم واریته کاپری کولوم در گوساله‌ها و بزهای کشتارشده به روش PCR

فهرست
الف- مقدمه 1
ب-چکیده 3
فصل اول:کلیات 5
1- تاریخچه 6
2- خصوصیات کلی مایکوپلاسما 6
3- مقاومت مایکوپلاسماها 8
4- طبقه بندی مایکوپلاسماها 9
5- طبقه بندی کلاستر مایکوئیدس 12
6- فیلوژنی 14
7- ساختمان 15
1-7-ساختمان مایکوپلاسما مایکوئیدس 15
2-7- ساختمان مایکوپلاسما کاپری کولوم 17
8- بیولوژی مولکولی 19
9- توالی‌های تکراری 23
10- پروتئینهای سطحی 25
11- فاکتور حدت 30
12- آنالیز پروتئین 32
13- طبقه بندی سویه‌ها 34
14- مشخصات گونه مایکوئیدس 35
15- کشت و رشد گونه مایکوئیدس 38
16- کشت و رشد گونه کاپری کولوم 41
1-16- محیط Thiacourt 41
17- بیماری پلوروپنومونی واگیر گاوان 44
1-17- علائم بالینی 45
2-17- علائم کالبدگشایی بیماری 47
3-17- پاتوژنز 50
1-3-17- مکانیسمهای مقابله با دستگاه ایمنی 53
4-17- اختصاصیت میزبان 57
5-17- انتقال بیماری 58
6-17- سیر همه گیری 59
1-6-17- مخزن 59
2-6-17- راه انتقال 59
7-17- پیشگیری و کنترل 60
1-7-17- اقدامات لازم برای حفاظت مناطق عاری از بیماری 61
2-7-17- اقدامات لازم هنگام شیوع بیماری 62
3-7-17- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومی 63
18- بیماری پلوروپنومونی واگیر بزان 63
1-18- علائم بالینی 64
2-18- علائم کالبد گشایی 66
19- گونه مایکوپلاسما کاپریکولوم کاپریکولوم 69
1-19- سندروم MASKePs 70
2-19- علائم بالینی 71
3-19- علائم کالبد گشایی 71
4-19- سندروم آگالاکتیه واگیر 73
20- گونه مایکوپلاسما کاپری 73
1-20- بیماریزایی 73
2-20- علائم کالبد گشایی 74
21- سیر همه‌گیری 75
1-21-مخزن 75
2-21-راه انتقال 76
3-21-جمعیت میزبان 77
22-پیشگیری وکنترل 77
1-22- اقدامات لازم برای محافظت مناطق عاری از بیماری 77
2-22- اقدامات لازم هنگام شیوع بیماری 78
3-22- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومی 78
23-واکسن 79
1-23-واکسن MmmLC 79
2-23-واکسن Mccp 79
3-23-واکسن Mcc 79 79-اختصاصیت میزبان در کلاستر مایکوئیدس ……………… 80
25-تشخیص افتراقی 80
1-25-شناسایی عامل بیماری زا 81
1-1-25-بررسی میکروسکوپیک اگزودای ریه از طریق تهیه اسمیر یا برش بافتی 81
2-25- تشخیص آزمایشگاهی 81
1-2-25- روش کشت و جداسازی 81
1-1-2-25- انتخاب نمونه ها 82
2-1-2-25- آماده سازی نمونه ها 82
3-25- تستهای بیوشیمی 83
4-25- روشهای سرولوژی 85
1-4-25- عوامل موثر در آزمایشات سرولوژی 85
2-4-25- تست مهاری رشد 87
3-4-25- تست ایمونو فلورسانس 88
4-4-25- تست رسوب ژلی 88
5-4-25- تست فیکساسیون کامپلمان 89
6-4-25- تست ممانعت از هماگلوتیناسیون 89
7-4-25- تست آگلوتیناسیون لاتکس 90
8-4-25- تست الیزای رقابتی 91
9-4-25- سایر تستهای تشخیصی 94
5-25 – مشکلات روشهای سنتی 94
6-25- تشخیص با استفاده از PCR 95
فصل دوم: روش کار
26- روش کار 101
1-26- جمع آوری نمونه 101
1-1-26- مواد لازم 101
2-1-26- بخش جمع آوری نمونه 101
3-1-26- نمونه برداری 103
2-26- کشت و جداسازی نمونه ها 104
1-2-26- مواد لازم 104
2-2-26- طرز تهیه محیط کشت اختصاصی برای جداسازی مایکوپلاسمای نشخوار کنندگان 106
1-2-2-26- مواد لازم 106
2-2-2-26- روش تهیه محیط کشت 107
3-26- استخراج DNA مایکوپلاسما 109
1-3-26- روش استخراج DNA از نمونه های ارسالی 109
4-26- فرایند PCR 110
1-4-26- مواد لازم 110
2-4-26- آماده سازی مواد جهت واکنش PCR 112
1-2-4-26- افزوده سازی DNA نمونه‌ها 112
2-2-4-26- افزوده سازی DNA کلونیهای جدا شده 115
3-2-4-26- تهیه مخلوط اصلی اولیه 115
3-4-26- پرایمرها 115
4-26- واکنش PCR 117
5-26- تهیه ژل الکتروفورز 118
1-5-26- طرز تهیه محلول اتیدیوم برماید 119
6-26- الکتروفورز 121
7-26- رویت باندهای ایجاد شده 122

فصل سوم: نتایج
27- نتایج 124
1-27- جداسازی 124
1-1-27- بررسی عملکرد محیط کشت 124
2-1-27- نتایج کشت نمونه های ارسالی 124
1-2-1-27- نتایج روز پنجم 125
2-2-1-27- نتایج روزهفتم تا دهم 125
3-2-1-27- نتایج روزپانزدهم 126
2-27- نتایج PCR 126
1-2-27- نتایج PCR نمونه ها با پرایمر جنس 126
2-2-27- تائید کلونی های جدا شده 127
3-2-27- نتایج PCR نمونه ها با پرایمر کلاستر مایکوئیدس 127
4-2-27- نتایج PCR نمونه ها با پرایمر گونه آگالاکتیه 128
5-2-27- نتایج PCR نمونه ها با پرایمر گونه مایکوئیدس کلونی بزرگ 129
3-27- نتایج کالبد گشایی 130
1-3-27- معیار انتخاب 130
فصل چهارم: بررسی نتایج
نمودارها 131
فصل پنجم: بحث
28- بحث 139
1-28- ضایعات کالبد گشایی 139
2-28- میزان وقوع عفونت تنفسی مایکوپلاسما 141
3-28- روش کشت 142
4-28- روش PCR 147
5-28- فراوانی گونه ها 152
29- خلاصه انگلیسی 159
30- منابع 160
فهرست تصاویر
تصویر شماره 1: کلونی تخم مرغی شکل مایکوپلاسما پس از سومین ساب کالچر 125

تصویر شماره 2: آزمایش PCR برای تشخیص جنس مایکوپلاسما در نمونه ریه 127

تصویر شماره 3: آزمایش PCR برای تشخیص کلاستر مایکوئیدس در نمونه ریه 128

تصویر شماره 4: آزمایش PCR برای تشخیص گونه آگالاکتیه درنمونه ریه 129
تصویر شماره 5: آزمایش PCR برای تشخیص گونه مایکوئیدس مایکوئیدس کلونی بزرگ 130
فهرست جداول
جدول1: طبقه بندی مایکوپلاسما 11
جدول 2: معرفی اعضا کلاستر مایکوئیدس و خصوصیات بیماریزایی آنها 11
جدول 3: احتیاجات غذایی برای رشد مایکوپلاسماهای کلاستر مایکوئیدس 39
جدول 4 : مقادیر موردنیاز جهت تهیه مخلوط اصلی اولیه 112
جدول 5: مواد مورد نیاز واکنش تکثیر 114
جدول6 : پرایمرهای استفاده شده در واکنش تکثیر 116
جدول 7 : برنامه واکنش پرایمرها 118
جدول8: : فرمول تهیه محیط TBE(5X) 120
جدول9: میزان اتیدیوم بروماید مصرفی جهت ساختن مقادیر متفاوت ژل 120
نمودار شماره 1: درصد مایکوپلاسمای جدا شده به روش کشت در عفونت تنفسی
گله‌های مورد مطالعه 132
نمودارشماره 2: درصد حضور مایکوپلاسما درعفونت تنفسی گله‌های مورد
مطالعه به روشPCR 132
نمودار شماره3 : مقایسه روشهای کشت و PCR در تشخیص مایکوپلاسما ی موجود در عفونت تنفسی گله‌های مورد مطالعه 133
نمودار شماره4: مقایسه نتایج کشت وPCR نمونه‌ها در گله‌های مورد مطالعه (n=100) 133
نمودار شماره 5: مقایسه نتایج کشت و PCR مایکوپلاسما در گاو (n=50) 134
نمودار شماره 6: مقایسه نتایج کشت و PCR مایکوپلاسما در گله های گوسفند (n=30) 134
نمودار شماره 7: مقایسه نتایج کشت و PCR در گله‌های بز (n=20) 135
نمودار شماره8: نمودار شماره 8:مقایسه نتایج تشکیل کدورت در محیط براث و PCR مایکوپلاسما در گله‌های مورد مطالعه (n=100) 135
نمودار شماره 9: نمودار شماره9:مقایسه نتایج ایجاد کدورت در محیط براث و جداسازی مایکوپلاسما در گله‌های مورد مطالعه (n=100) 136
نمودار شماره 10: نمودار شماره10: مقایسه نتایج تشکیل کدورت در محیط براث و PCR مایکوپلاسما
در گله‌های گاو(n=50) 136
نمودار شماره 11: نمودار شماره 11:مقایسه نتایج تشکیل کدورت در محیط براث و PCR مایکوپلاسما
در گله‌های بز (n=20) 137
نمودار شماره12: مقایسه نتایج تشکیل کدورت در محیط براث و PCR مایکوپلاسما در گله‌های گوسفند (n=30) 137